mikpang_hitungan MPN

MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel.

Contoh :

Data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000.

Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin “sering” tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin “jarang” tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif “kadang-kadang tetapi tidak selalu”. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan.

Asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :

-   bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel

-   sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).

-   media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut.

-   jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.

MPN dinilai dari perkiraan unit tumbuh (Growth Unit / GU) seperti CFU, bukan dari sel individu. Meskipun begitu baik nilai CFU atau MPN dapat menggambarkan seberapa banyak sel individu yang tersebar dalam sampel. Metode MPN dirancang dan lebih cocok untuk diterapkan pada sampel yang memiliki konsentrasi <100/g atau ml. Oleh karena itu nilai MPN dari sampel yang memiliki populasi mikroorganisme yang tinggi umumnya tidak begitu menggambarkan jumlah mikroorganisme yang sebenarnya. Jika jumlah kombinasi tabung positif tidak sesuai dengan tabel maka sampel harus diuji ulang. Semakin banyak seri tabung maka semakin tinggi akurasinya tetapi juga akan mempertinggi biaya analisa.

Pemilihan media sangat berpengaruh terhadap metode MPN yang dilakukan. Umumnya media yang digunakan mengandung bahan nutrisi khusus untuk pertumbuhan bakteri tertentu. Misalnya dalam mendeteksi kelompok coliform dapat menggunakan media Brilliant Green Lactose 2% Bile (BGLB) broth. Di dalam media ini mengandung lactose dan garam empedu (bile salt) yang hanya mengizinkan coliform  untuk tumbuh. Jika terdapat ketidaksesuaian jenis media dan bakteri yang diinginkan maka metode MPN akan menghitung bukan bakteri yang dituju. Untuk menghitung coliform dapat menggunakan Lauryl Sulphate Tryptose (LST) broth, sedangkan untuk menghitung E.coli diperlukan media EC (Escherichia coli) broth.  Berdasarkan prinsip diatas apakah mungkin metode MPN dapat untuk menghitung jenis bakteri selain jenis-jenis coliform ?

Jadi nilai MPN adalah suatu angka yang menggambarkan hasil yang PALING MUNGKIN.

Aspek peluang dalam metode MPN

Berdasarkan prinsip diatas maka “seharusnya/sebaiknya” jumlah tabung positif pada pengenceran 1/10 > 1/100 > 1/1000 (misalnya 5-3-1) karena setiap pengenceraan mengurangi jumlah mikroorgansime target dan akibatnya semakin kecil kesempatannya untuk membuat tabung menjadi positif. Namun seringkali hasil yang didapat tidak sesuai dengan logika peluang, seperti 5-3-4 yang menghasilkan nilai 210 (lihat tabel dibawah). Bisa saja banyak sel tidak sengaja terambil dan memperbanyak pengenceran selanjutnya atau homogenisasi tidak berlangsung sempurna.

 

Untuk memahami peranan peluang dalam mendistribusikan sel sehingga menghasilkan tabung positif maka jumlah tabung positif (digaris bawah) pada tabel dicoba untuk dirunut dan diilustrasikan kembali dalam proses penanamannya pada gambar berikut (dianggap bahwa nilai MPN/ml sama dengan sel/ml). Namun perlu diingat, jumlah sel yang terambil tidak selalu seperti itu, semuanya adalah peluang dan angka yang didapat adalah angka paling mungkin.

 

Perbandingannya dengan plate count

Telah disebutkan diatas bahwa MPN cocok untuk sampel dengan konsentrasi mikroorganisme rendah khususnya dari jenis sampel air, susu, atau makanan terutama yang memiliki partikel-partikel yang larut didalamnya. Partikel-partikel tersebut dimungkinkan mampu mempengaruhi keakuratan perhitungan bakteri jika menggunakan metode penanaman pada cawan petri. Hal ini karena sel bakteri yang terpisah dapat mengelompok pada partikel makanan dan mungkin tidak terpisah pada proses homogenisasi dalam pengenceran bertingkat sehingga saat diplating satu kumpulan tersebut menjadi satu koloni dan membuat data plate count menjadi bias. Metode MPN dapat mengeliminasi kekurangan ini.

  

Kaidah pemilihan tabung positif dan cara pelaporannya

Syarat umum yang dipakai dalam pemilihan tabung positif adalah

- Pilih pengenceran terendah yang tidak semua tabung menghasilkan tabung positif

- Pilih pengenceran tertinggi yang paling tidak memiliki satu tabung positif

- Pilih semua pengenceran diantaranya.

- Kalikan setiap seri tabung yang dipilih dengan pengenceran yang diambil.

Misalnya : dari inokulum 1, 0,1, 0,01, 0,001 dan 0,0001 menghasilkan kombinasi tabung positif 5-4-3-1-0 maka dipilih 5-4-3-1-0 bukan 5-4-3-1-0 atau 5-4-3-1-0 sehingga didapat nilai MPN 33/ml.

Namun tidak semua keadaan menggambarkan kondisi ideal seperti diatas. Untuk kasus semua seri tabung menghasilkan tabung positif dan tidak semua pengenceran menghasilkan tabung positif dapat dilihat pada contoh berikut

Contoh a) 5-5-1-0-0 dan b) 4-5-1-0-0 ; pilih pengenceran tertinggi yang menghasilkan seluruh tabung positif dan dua pengenceran berikutnya.

Contoh c) 5-4-4-1-0 ; jika pada tingkat pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif (10³ menghasilkan 1 tabung positif) maka pada tingkat pengenceran tersebut tingkat pengenceran tertinggi yang dipilih.

Contoh d) 5-4-4-0-1 ; Jika pada tingkat pengenceran tertentu semua menghasilkan tabung negatif tetapi pengenceran selanjutnya masih terdapat tabung positif, maka yang dinyatakan tabung positif adalah tingkat pengenceran sebelumnya.

Contoh e) 5-5-5-5-2 ; Jika pada tingkat pengenceran tertinggi masih terdapat tabung positif, maka pilih tingkat pengenceran sebelumnya.

Contoh f) 0-0-1-0-0 ; jika tingkat pengenceran tertentu menghasilkan tabung positif maka pilih dua tingkat pengenceran sebelumnya

Contoh g) 4-4-1-1-0 dipilih menjadi 4-4-2 ; jika pada pengenceran yang lebih tinggi masih menghasilkan tabung positif maka tambahkan tabung positif tersebut ke tingkat pengenceran sebelumnya.

Catatan : pada contoh e hasil untuk 5-5-2 dengan inokulum 1,0, 0,01 dan 0,001 ml adalah 540 tetapi karena diambil pengenceran dari (inokulum) 0,01, 0,001 dan 0,0001 maka nilai harus dikalikan 10. Begitu pula sebaliknya untuk contoh g yang diambil dari pengenceran (inokulum) 1, 0,1 dan 0,01 maka nilai 47 harus dibagi 10.

Menghitung angka MPN tanpa tabel

Nilai MPN ternyata dapat dicari dengan rumus berikut (Thomas formula) :

 

Contoh 1 :

Untuk hasil (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10) jika digunakan tabel maka dipilih (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10) yaitu kombinasi 10-4-2 = 70/g tetapi dalam perhitungan hanya gunakan (10/10, 10/10, 4/10, 2/10, 0/10).

 

Contoh 2 :

Untuk hasil (5/5, 3/5, 1/5, 0/5) pemilihan dipilih (5/5, 3/5, 1/5, 0/5) yaitu kombinasi 5-3-1 = 110/ml tetapi dalam perhitungan hanya gunakan (5/5, 3/5, 1/5, 0/5)

Dengan cara yang sama maka MPN/g

=  4/(0,024x0,055)^1/2

=  4/0,0363

=  110/ml , (sama dengan hasil yang didapatkan dari tabel)

Jumlah seri tabung dan pengenceran yang disarankan

Menurut USDA dan FSIS untuk mengantisipasi jika jumlah mikroorganisme dalam sampel >10 CFU/g atau ml maka disarankan menanam sampel 10 ml pada 3 seri tabung, 1 ml pada 3 seri tabung lalu selanjutnya dilakukan pengenceran sampai 10⁴ dan tiap pengenceran ditanam 1 ml pada 3 seri tabung seperti skema di bawah ini.

tabel MPN untuk 3 seri dan 5 seri tabung (tekan disini)
tabel MPN untuk 10 seri tabung (tekan disini)

E. Indra Pradhika, 2011.

Diterjemahkan, diolah dan dikaji dari :

Blodgett, Robert. 2006. Appendix 2, Most Probable Number from Serial Dilution. BAM (Bacteriological Analytical Manual), Chapter 4. FDA (Food and Drug Administration).

Feng, Peter,  S. D. Weagant, and M. A. Grant. 2002. Enumeration of Escherichia coli and the Coliform Bacteria. BAM (Bacteriological Analytical Manual), Chapter 4. FDA (Food and Drug Administration).

BSN, 2006. SNI 01-2332.1-2006, Cara Uji Mikrobiologi- Bagian 1 : Penentuan Coliform dan Escherichia coli pada Produk Perikanan, ICS.67.120.30. Badan Standardisasi Nasional.

USDA/FSIS. 2008. Most Probable Number Procedure and Tables. USDA (United States Departement of Agriculture) / FSIS (Food Safety and Inspection Service).

cara pembuatan media pertumbuhan mikroorganisme

mikroba seperi makhluk hidup lainnya memerlukan nutrisi pertumbuhan. Pengetahuan akan nutrisi pertumbuhan ini akan membantu di dalam mengkultivasi, mengisolasi dan mengidentifikasi mikroba.
Mikroba memiliki karakteristik dan ciri yang berbeda-beda di dalam persyaratan pertumbuhannya. Ada mikroba yang bisa hidup hanya pada media yang mengandung SULFUR dan ada pula yang tidak mampu hidup dan seterusnya. Karakteristik persyaratan pertumbuhan mikroba inilah yang menyebabkan bermacam-macamnya media penunjang pertumbuhan mikroba.
Klasifikasi media pertumbuhan mikrobila terangkum dalam tabel di bawah ini :

Tabel 4 : Klasifikasi media pertumbuhan mikrobial
KLASIFIKASI	NAMA/SEBUTAN	CONTOH
Sumber Nutrien	Alamiah	Susu, kaldu
	Buatan/Artifisial	Campuran zat kimia
Keadaan Fisik	Padat-Ireversibel	Serum darah terkoagulasi
	Padat-Reversibel	Agar nutrien
	Setengah padat	Agar lunak
	Cair	Kaldu nutrien
Komponen Kimiawi penyusun	Kompleks (komposisi “unknown”)	Agar nutrien
	Kimiawi-Sintetik (komposisi “known”)	Amonium sulfat, medium garam, glukosa.
Persyaratan nutrisi bakteri	Enrichment Media (media diperkaya)	Kaldu Infusi Jantung
	Differential media (Media diferensial)	Agar Eosin-biru metilen
	Selected Media (media terpilih)	Agar deoksikolat
	Test Media (media uji)	Media uji Vit B12

Keterangan :
1)    Ireversibel = Sifat tidak dapat kembali lagi ke fase semula. Seperti darah yang telah berkoagulasi (menggumpal) tidak dapat lagi kembali menjadi darah cair.
2)    Reversibel = Sifat yang dapat kembali ke fase semula setelah perubahannya. Seperti agar yang dapat memadat apabila didinginkan dan dapat mencair kembali apabila dipanaskan lagi.
3)    Enrichment Media = Media yang dapat menunjang pertumbuhan bakteri yang rewel, yaitu bakteri yang memiliki persyaratan untuk tumbuh yang rumit. Bakteri ini tidak dapat tumbuh pada media biasa karena membutuhkan beberapa nutrisi pengaya yang dapat menyokong pertumbuhannya.
4)    Differential Media = Media yang digunakan untuk membedakan bentuk dan karakter koloni bakteri yang tumbuh. Beberapa bakteri dapat tumbuh di dalam media ini, tetapi hanya beberapa jenis saja yang mempunyai penampilan pertumbuhan yang khas. Media ini berguna untuk isolasi dan identifikasi bakteri.
5)    Selected Media = Media pertumbuhan yang terpilih dan khusus, maksudnya media ini dapat menghambat pertumbuhan tipe mikroba lain namun membiarkan tipe mikroba lain dapat tumbuh. Media ini sangat berguna untuk identifikasi.
6)    Test Media = Media yang digunakan untuk mengukur secara kuantitatif suatu vitamin maupun antibiotik.
Penyiapan Media
Media alamiah, misalnya susu skim, tidak begitu sulit di dalam penyiapannya sebagai media pertumbuhan mikroba, karena hanya cukup dengan dituang ke dalam wadah yang telah disterilkan. Media dalam bentuk kaldu nutrien atau yang mengandung agar, disiapkan dengan cara melarutkan masing-masing bahan yang dibutuhkan atau lebih mudah lagi dengan cara menambahkan air pada suatu produk komersial berbentuk medium bubuk yang sudah mengandung semua nutrien yang dibutuhkan.
Pada praktisnya, semua media tersebut secara komersial dalam bentuk bubuk, seperti PCA (Plate Count Agar), NA (Nutrient Agar), TSA (Trypticase Soy Agar) dan lain lain. Penyiapan media komersial ini pada umumnya mengikuti langkah-langkah sebagai berikut :
1.     Setiap komponen atau medium terhidrasi (bubuk) dilarutkan ke dalam aquades atau air suling pada volume yang tepat dan sesuai.
2.     pH media ditentukan dan disesuaikan dengan nilai optimum pertumbuhan mikroba sebagaimana tertera pada kemasan media komersial.
3.     Dituang ke dalam media yang sesuai, seperti erlenmeyer atau tabung labu dan disumbat dengan penutup yang kuat.
4.     Disterilisasi dengan suhu dan waktu yang adequate (memadai) sesuai dengan yang tertera pada kemasan. (Umumnya pada suhu 121^oC selama 15 menit).

Beberapa media yang umum digunakan

PLATE COUNT AGAR (Merck)
Formula : Casein-Peptone Glucose Yeast Extract Agar
Penyimpanan :
-          Simpan di tempat yang kering dan tertutup rapat.
-          Simpan pada suhu 15^oC – +25^oC.
-          Jaga dari cahaya.
Preparasi :
-          Larutkan 22.5 gram ke dalam 1 liter air distilasi (aquades) atau air deionisasi.
-          Panaskan dengan air mendidih atau aliran uap hingga homogen.
-          Sterilisasi ke dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121^oC.
-          pH akhir = 7.0 0.2 pada 25^oC.

NUTRIENT AGAR DEHYDRATED (Dafco Laboratories)
Formula per liter :
-          Bacto Beef Extract           : 3 gr
-          Bacto Peptone       : 5 gr
-          Bacto Agar            : 15 gr
Penyimpanan :
-          Simpan di tempat yang kering dan tertutup rapat.
-          Simpan pada suhu di bawah 30^oC.
-          Jaga dari cahaya.
Preparasi :
-          Larutkan 23 gram ke dalam 1 liter air distilasi (aquades) atau air deionisasi.
-          Panaskan dengan air mendidih atau aliran uap hingga homogen.
-          Sterilisasi ke dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121^oC-124^oC.
-          pH akhir = 6.8 + 0.2 pada 25^oC.
TRYPTIC SOY BROTH (Merck)
Formula gr/liter :
-          Peptone Casein                                   : 17 gr
-          Peptone Soymeal                               : 3.0 gr
-          b(+) Glucose                                      : 2.5 gr
-          Sodium Chloride                                 : 5.0 gr
-          diPottasium hydrogenophosphate        : 2.5 gr
Penyimpanan :
-          Simpan di tempat yang kering dan tertutup rapat.
-          Simpan pada suhu 15^oC – +25^oC.
-          Jaga dari cahaya.
Preparasi :
-          Larutkan 30 gram ke dalam 1 liter air distilasi (aquades) atau air deionisasi.
-          Panaskan dengan air mendidih atau aliran uap hingga homogen.
-          Sterilisasi ke dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121^oC.
-          pH akhir = 7.3 0.2 pada 25^oC.

TRYPTIC SOY AGAR (Merck)
Formula gr/liter :
-          Peptone Casein      : 15 gr
-          Peptone Soymeal   : 5.0 gr
-          Sodium Chloride     : 5.0 gr
-          Agar-agar              : 15 gr
Penyimpanan :
-          Simpan di tempat yang kering dan tertutup rapat.
-          Simpan pada suhu 15^oC – +25^oC.
-          Jaga dari cahaya.
Preparasi :
-          Larutkan 40 gram ke dalam 1 liter air distilasi (aquades) atau air deionisasi.
-          Panaskan dengan air mendidih atau aliran uap hingga homogen.
-          Sterilisasi ke dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121^oC.
-          pH akhir = 7.3 0.2 pada 25^oC.

BACTO^TM PEPTONE (Difco-Becton Dickinson)
Protein pencernaan enzimatis
Penyimpanan :
-          Simpan di tempat yang kering dan tertutup rapat.
-          Simpan pada suhu 2^oC – 30^oC.
-          Jaga dari cahaya.
Preparasi :
-          Larutkan 1 gram ditambah 9 gr NaCl (garam) ke dalam 1 liter air distilasi (aquades) atau air deionisasi.
-          Panaskan dengan air mendidih atau aliran uap hingga homogen.
-          Sterilisasi ke dalam autoklaf selama 15 menit pada suhu 121^oC.

syarat utama media pertumbuhan


Media pertumbuhan bakteri sangat beragam, mulai dari media selektif, media penyubur, media diferensial, dll. Masing-masing media memiliki fungsi berbeda dan digunakan tergantung tujuan dari praktikan. Berikut adalah syarat yang harus dipenuhi media :

a.       Mengandung nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme yang sedang   dikembangkan.

b.      Memiliki kelembaban optimum bagi pertumbuhan mikroorganisme.
c.       Mengandung oksigen (kultur bakteri aerob) dan pH yang sesuai.
d.      Harus bebas dari mikroba lain dan steril
Ada 3 jenis media pengembangbiakan berdasarkan konsistensinya, antara lain :
a.       media padat, yaitu media berbentuk padat yang mengandung agar 1-1.5%, misalnya nutrien agar
b.      media cair, yaitu media berbentuk cair yang tidak mengandung agar, misalnya nutrien broth.
c.       media semi padat, yaitu media yang berbentuk padat pada suhu dingin, dan berbentuk cir bila suhu panas, misalnya media SIM (media yang digunakan untuk uji produksi sulfur, indol, motilitas)
Berdasarkan komposisi penyusunnya, media dibedakan menjadi 2, yaitu media sintetis dan media non-sintetis. Media sintetis adalah media yang telah diketahui susunan kimia nutrisinya, seperti media pepton agar yang terbuat dari pepton, agar dan NaCl, sedangkan media non-sintetis, yaitu media yang belum diketahui susunan kimia nutrisinya, seperti kentang, wortel, kaldu, dll.